La eficacia de las nanopartículas de plata biosintetizadas contra aislamientos de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8876 (2023) Citar este artículo

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La alta resistencia a los antibióticos de Pseudomonas aeruginosa (PA) hace que sea fundamental desarrollar agentes antimicrobianos alternativos que sean efectivos y asequibles. Una de las muchas aplicaciones de las nanopartículas de plata (NP de Ag) es su uso como agente antimicrobiano contra bacterias resistentes a los antibióticos comunes. El propósito clave de esta investigación fue evaluar la eficacia antibacteriana y antibiopelícula de las Ag NP biosintetizadas frente a seis cepas de PA clínicamente aisladas que forman biopelículas y una cepa de referencia (ATCC 27853). Las NP de Ag se biosintetizaron utilizando un extracto de semilla de Peganum harmala como agente reductor. Las NP de Ag se caracterizaron mediante espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis) y microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM). El efecto de las NP de Ag en la formación y erradicación de biopelículas se examinó a través de ensayos en placas de microtitulación y se determinaron las concentraciones mínimas inhibitorias (MIC) y mínimas bactericidas (MBC). Además, se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) para examinar los efectos de Ag NP en la expresión de siete genes que codifican biopelículas de PA (LasR, LasI, LssB, rhIR, rhII, pqsA y pqsR). Las NP de Ag biosintetizadas tenían forma esférica con un diámetro medio de 11 nm. La MIC para cada cepa de PA fue de 15,6 µg/ml, mientras que la MBC fue de 31,25 µg/ml. Todas las cepas de PA expuestas a Ag NP en concentraciones subinhibitorias (0,22–7,5 µg/ml) mostraron efectos inhibidores significativos sobre el crecimiento y la formación de biopelículas. El metabolismo de la biomasa y el biofilm se redujo dependiendo de la concentración de Ag NP. La expresión de los genes de detección de quórum de todas las cepas se redujo significativamente a una concentración de Ag NP de 7,5 µg/ml. Los resultados demuestran el amplio rendimiento antibacteriano y antibiopelícula in vitro de las NP de Ag y su potencial en el tratamiento de la infección por AP. Se recomienda que futuros estudios examinen la posible sinergia entre Ag NP y antibióticos.

Pseudomonas aeruginosa (PA) es un patógeno nosocomial común que puede causar la muerte en personas con inmunosupresión, malignidad, quemaduras, heridas traumáticas y fibrosis quística1. PA puede formar una biopelícula en varias superficies abióticas, incluidos implantes artificiales, catéteres urinarios, tubos endotraqueales y lentes de contacto2. Las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) forman estructuras similares a matrices de biopelículas que rodean las comunidades bacterianas3. Las biopelículas son una preocupación importante, ya que pueden resistir el sistema inmunitario del huésped y muchos antimicrobianos3. Los péptidos antimicrobianos son repelidos electrostáticamente o descompuestos por la matriz del biofilm, protegiendo a las células del interior de la fagocitosis y la respuesta inmunitaria del huésped4,5. Un sistema de comunicación de célula a célula llamado detección de quórum (QS) regula varios procesos en AP, incluida la producción de biopelículas6.

Las células objetivo de muchos antimicrobianos se encuentran profundamente arraigadas dentro de la matriz del biofilm, lo que hace que su tratamiento sea extremadamente difícil7. La resistencia a los antibióticos es ahora un importante problema de salud mundial8, y la necesidad de tratamientos sin antibióticos para enfermedades microbianas resistentes a los medicamentos ha aumentado significativamente. Las nanopartículas ofrecen un enfoque alternativo y fácil de sintetizar para el tratamiento de las infecciones por PA, ya que su pequeño tamaño y su alta relación superficie/volumen las hacen eficaces contra las biopelículas9.

De muchas nanopartículas comúnmente producidas, las NP de Ag se destacan por tener una capacidad sobresaliente para combatir los aislamientos bacterianos patógenos multirresistentes10. Es ampliamente reconocido que las NP de Ag tienen actividad antibacteriana y antibiopelícula tanto en bacterias patógenas no resistentes como resistentes10,11,12. Las Ag NP ejercen su actividad antibiopelícula al reconocer la estructura de peptidoglicano de las membranas bacterianas y unirse a la matriz de exopolisacáridos. Luego, la estructura del biofilm se daña gravemente o se destruye a través del estrés oxidativo y el daño del ADN producido por la producción de ROS y la liberación de iones13,14,15. Las Ag NP también tienen un potencial significativo para uso médico y otros usos no médicos debido a su amplio rango de tamaños, capacidad de autoensamblaje y alta actividad antibacteriana16.

La nanotecnología mediada por biogenia incorpora principios de química verde en la producción de nanopartículas. Los extractos de plantas han sido ampliamente estudiados en la fabricación de nanopartículas metálicas y pueden aumentar su monodispersidad. Las biomoléculas que se encuentran en las plantas (p. ej., flavonas, fenoles, proteínas, polisacáridos, terpenoides, alcaloides, enzimas, aminoácidos y alcoholes) son agentes reductores eficaces y sirven como agentes protectores que estabilizan y controlan la estructura de las NP17,18,19,20 . Las técnicas biogénicas proporcionan un proceso limpio y ecológico para sintetizar las nanopartículas utilizadas en muchas aplicaciones cosméticas y farmacéuticas. Por lo tanto, existe un interés generalizado en la aplicación de técnicas biogénicas para la producción verde de nanopartículas21,22.

La planta glabra y perenne Peganum harmala, comúnmente conocida como Harmal, crece en suelos arenosos en zonas semiáridas. El arbusto mide entre 0,3 y 0,8 m de largo y contiene cápsulas de semillas esféricas con más de 50 semillas y flores blancas. En Medio Oriente, esta planta es ampliamente cultivada para usos medicinales y se encuentra en las regiones marginales y desérticas de Jordania23 donde tradicionalmente se ha utilizado como antiséptico y desinfectante quemando o hirviendo sus semillas24. La planta se ha utilizado para el tratamiento de una variedad de dolencias humanas que incluyen lumbago, asma, cólico, ictericia y como emenagogo estimulante25,26. También se ha afirmado que tiene propiedades antibacterianas, antivirales y antifúngicas26,27.

En el estudio actual, Pharmala se utilizó como agente reductor en la biosíntesis de Ag NP. Se examinaron las propiedades antibacterianas y antibiofilm de las Ag NP en aislamientos clínicos de seis cepas de PA. También se evaluó el efecto de la exposición a diferentes concentraciones de Ag NP durante la formación de biopelículas. Además, se investigó la influencia de las NP de Ag en la expresión de genes implicados en la regulación de QS y la síntesis de polisacáridos de la biopelícula de PA.

En este estudio se utilizaron la cepa estándar PA 27853 de la American Type Culture Collection (ATCC), así como seis aislados clínicos (PA1, PA2, PA3, PA4, PA5 y PA6). El PA ATCC se obtuvo del panel internacional de PA y su secuencia genómica completa está disponible28. Las cepas clínicas se aislaron de muestras de esputo de pacientes con fibrosis quística en el laboratorio de microbiología del Hospital Príncipe Hamza de Jordania. La tinción de Gram, la síntesis de pigmentos verdes en agar nutritivo, el crecimiento en agar MacConkey, la prueba de oxidasa, la motilidad, el crecimiento en agar cetrimida medio selectivo y la capacidad de crecimiento a 42 °C se utilizaron para identificar la bacteria PA. Para la verificación se utilizó el sistema informático de identificación automática de bacterias VITEK2 (Bio Merière, Lyon, Francia).

Para enriquecer las muestras se utilizó la técnica de caldo Brain-Heart Infusion (BHI) (OxoidTM). Después del enriquecimiento, las muestras se cultivaron utilizando los enfoques de placa de rayas y placa de vertido en Pseudomonas Cetrimide Agar (PSA) (OxoidTM). Para cada cepa, los investigadores iniciaron subcultivos a partir de colonias individuales, todas las cuales se cultivaron aeróbicamente en placas de PSA a 37 °C. Después de 18 a 24 h de incubación, se prepararon cultivos frescos a concentraciones de 0,5 en la escala de McFarland (1,5 × 108 CFU/mL). Se probaron varias diluciones diferentes durante el proceso de evaluación.

Se recolectaron plantas enteras de P. harmala del área de Al-Hallabat de la gobernación de Zarqa en julio de 2022 de una granja del Ministerio de Agricultura. La identificación de las semillas de P. harmala se verificó por comparación con la muestra verificada que se encuentra en el herbario de la Facultad de Agricultura de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Jordania (JUST) y fue confirmada por el Profesor Asistente de Agricultura (Dr. Muayyad Bani-Hani). El espécimen comprobante (AM/2023/01/001) se depositó en el herbario ubicado en el Departamento de Protección y Producción Vegetal de la Universidad de Jerash, Jordania. P. harmala se cosechó de acuerdo con todas las directrices y leyes institucionales, nacionales e internacionales.

Las semillas se lavaron con agua bidestilada (Sigma-Aldrich HPLC Plus Water), se secaron completamente a temperatura ambiente y se molieron mecánicamente hasta obtener un polvo grueso. Cinco gramos de este polvo se combinaron con 50 ml de agua bidestilada y se calentaron a 70 °C durante 15 minutos antes de filtrarlos dos veces a través de papel de filtro Whatman. Se usó microfiltración a través de un filtro de membrana de jeringa de 0,22 mm para producir un extracto acuoso claro con un pH de 5,4 a 25 °C.

Una solución de 50 ml de AgNo3 3 mM se calentó a 80 ℃ en un matraz Erlenmeyer de 100 ml cubierto con papel aluminio y se mezcló usando un agitador magnético a una velocidad continua de 1100 rpm. Se añadió gota a gota extracto acuoso de semilla de P. harmala a una velocidad de 34 µl/min utilizando una micropipeta hasta que se habían añadido 4 ml. Un cambio en el color de la solución de naranja a marrón oscuro fue la primera indicación de la síntesis de Ag NP. A continuación, la solución se centrifugó a 6000 rpm durante 30 min tres veces para eliminar el Pharmala sin reaccionar.

Se utilizó espectroscopia UV-visible (UV-1900, SHIMADZU, Japón) para realizar un seguimiento visual de la biorreducción del AgNO3 y la producción de Ag NP biogénicas a partir del extracto acuoso de P. harmala. Se utilizó agua bidestilada como referencia de control. Cada análisis espectrofotométrico se realizó en una cubeta de cuarzo con un paso de luz de 1,00 cm. La resonancia de plasmón superficial (SPR) de las NP de Ag se midió con un espectrofotómetro UV-visible, utilizando longitudes de onda de 800 a 300 nm como marcador de la formación de NP de Ag.

El microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) (Versa 3D, FEI, Países Bajos) produce imágenes derivadas de electrones que pasan a través de una muestra delgada. Esto se utilizó para probar las características de morfología y tamaño de las nanopartículas de plata sintetizadas.

Se utilizó un difractómetro de rayos X para medir los espectros de difracción de rayos X (XRD) de las NP de óxido de zinc. Este estaba equipado con una fuente de radiación que comprendía CuKα, que tenía una longitud de onda de 0,154 nm. El contenedor de muestras medía 2 cm × 0,5 mm.

El análisis FT-IR de las NP de Ag y el extracto de semilla de P. harmala se realizó en el departamento de química de la Universidad Hashemite y permitió evaluar las relaciones entre los grupos funcionales del extracto de P. harmala y las NP de Ag sintetizadas dentro de un rango de número de onda de 3600–400 cm−1.

Se empleó la difusión en disco para evaluar la susceptibilidad de las cepas de PA a 10 antibióticos anti-pseudomonas de acuerdo con el procedimiento del Clinical Laboratory and Standards Institute (CLSI). La suspensión celular en solución salina se ajustó a 0,5 McFarland y se inoculó en Muller Hinton Agar-MHA para iniciar el crecimiento bacteriano exponencial (18–24 h) (Sigma-Aldrich). La placa se cubrió con discos de antibiótico, que luego se incubaron durante 18-24 h a 35 ± 2 °C. La susceptibilidad bacteriana a estos antibióticos se confirmó midiendo el diámetro de los halos de inhibición creados e interpretándolos de acuerdo con los valores establecidos por el CLSI29.

Se utilizaron diez antibióticos antipseudomonas diferentes: aztreonam 30 µg (ATM), ciprofloxacina 5 µg (CIP), piperacilina 100 µg (PRL), amikacina 30 µg (AK), ceftazidima 30 µg (CAZ), cefepima 30 µg (FEP) , gentamicina 10 µg (CN), levofloxacino 5 µg (LEV), imipenem 10 µg (IPM) y meropenem 10 µg (CT). Todos los discos antipseudomonas se adquirieron de Oxoid, Reino Unido.

La MIC de un agente antimicrobiano se refiere a la concentración mínima requerida para suprimir el crecimiento visible de los microbios objetivo después de 12 horas de incubación. La concentración mínima bactericida (MBC) se refiere a la concentración mínima necesaria para asegurar que ningún microbio permanezca viable después de la exposición al antimicrobiano (es decir, que no se observe crecimiento en cultivos posteriores en medios no tratados).

La CIM de las NP de Ag se determinó mediante el proceso de dilución en caldo de microtitulación30. Los Ag NP se emplearon contra la cepa de referencia ATCC PA 27853 y los seis aislados clínicos por triplicado y en tres experimentos separados. En cada prueba, se agregaron 100 μl de bacterias a una densidad de 5 × 105 CFU/ml en caldo Muller Hinton (MHB) (Oxoid) a las placas de ensayo de 96 pozos (Corning, NY) que contenían diferentes concentraciones de Ag NP. Se utilizó PA ATCC 27853 como control positivo mientras que el control negativo se inoculó en caldo incubado en condiciones idénticas pero sin adición de Ag NP.

Las concentraciones de Ag NP utilizadas para la prueba oscilaron entre 1 mg/ml y 3,9 μg/ml y se obtuvieron mediante una dilución en serie doble. Las microplacas inoculadas se incubaron durante 24 h a 37 °C y 150 rpm. El control se incubó durante 24 h a 37 °C y contenía caldo inoculado sin Ag NP. El punto final de MIC se refiere a la concentración mínima de Ag NP en la que no se pudo observar un crecimiento perceptible en los pocillos. Se utilizó una dilución de microtitulación a base de tetrazolio para la confirmación.

Dado que el NADH celular impulsa la creación de sales de formazán coloreadas, las sales de tetrazolio se utilizan con frecuencia como reactivos en pruebas biológicas para evaluar el comportamiento metabólico de las células vivas31. Por lo tanto, los tintes a base de tetrazolio se usan comúnmente para identificar CIM y evaluar biopelículas32. En este estudio se utilizó cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) como marcador metabólico de supervivencia bacteriana y desarrollo de biopelículas. Después de la incubación inicial de 24 h, se añadieron a los pocillos 40 μl de 0,2 mg/ml de TCC disueltos en agua desionizada y la incubación continuó durante 4 a 6 h más a 37 °C. A continuación, se evaluaron los cambios de color y se compararon con los de los controles.

La concentración más baja que no cambiaba el color del colorante se consideró como la CMI frente a la bacteria diana. Para lograr confiabilidad, el experimento se repitió tres veces cada uno con controles positivos y negativos.

Después de establecer las CIM de Ag NP, se sembraron alícuotas de 50 µl de todos los pozos que no mostraban un crecimiento bacteriano evidente. Se colocaron en placas de agar BHI y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Posteriormente, la eliminación del 99,9 % de las bacterias por la concentración más baja de Ag NP se tomó como punto final de CMM (Figura 1 complementaria).

Se emplearon placas de microtitulación transparentes estériles y sin tratar con fondos planos de 96 pocillos (BD Falcon)33 para examinar el crecimiento bacteriano y el desarrollo de biopelículas bajo las diferentes concentraciones de Ag NP. Para realizar la prueba de crecimiento, se crearon suspensiones estándar de cada cultivo de PA. Se aplicaron alícuotas de 105 µl de caldo de soja triptona (TSB) a cada pocillo, a los que se añadieron alícuotas de 20 µl de bacterias y se combinaron con 125 µl de las diferentes concentraciones de Ag NP (0,225–7,5 µg/ml). Esto dio un volumen total de 250 µl en cada pocillo de la bandeja de microtitulación. Todos los ensayos se realizaron tres veces. También se usaron controles positivos y negativos, el primero contenía PA y TSB (y no Ag NP) y el último solo TSB.

Una vez completada la preparación, los cultivos se sometieron a incubación aeróbica durante 24 h a 37 °C, durante las cuales se almacenaron en la oscuridad y se sometieron a agitación. Después de la incubación, se determinaron los números de células a diferentes concentraciones de Ag NP mediante la evaluación de la densidad óptica (DO) a 600 nm (Infinite® 200 PRO NanoQuant, TECAN). El valor de crecimiento celular final para cada concentración de Ag NP se calculó como la diferencia entre los promedios de las lecturas de los pocillos con y sin inoculación de PA. Todas las células exhibieron expansión celular planctónica y asociada a biopelícula.

Se utilizó un enfoque espectrofotométrico para cuantificar la producción de biopelículas midiendo su biomasa total, que incluye células bacterianas y EPS34,35. Se crearon dos pozos distintos en placas de microtitulación separadas en paralelo para cada condición de prueba. A continuación, uno de los pocillos se tiñó con Crystal Violet (CV) y el otro con el colorante metabólico TTC.

Después de incubar la placa durante 24 h sin agitar (muy parecido a un experimento de crecimiento), cada pocillo se aspiró y se lavó tres veces en solución salina fisiológica estéril (250 µl). Después de aspirar el pozo, las placas se agitaron vigorosamente para eliminar cualquier bacteria no unida.

Los microorganismos restantes de la primera placa se fijaron en 200 µl de metanol al 99 %. Las placas se dejaron durante 15 min, luego de lo cual se vaciaron y se dejaron secar. A continuación, cada placa se tiñó durante 5 min con Hucker CV al 2%, una solución resistente a la tinción de Gram, aplicada a 200 µl a cada pocillo. Para eliminar cualquier material de tinción adicional, los pocillos se limpiaron tres veces en 200 µl de agua estéril. Se tuvo cuidado de no romper la biopelícula durante la etapa de lavado. A continuación, las placas se dejaron secar de nuevo antes de que el colorante unido a las células se volviera a solubilizar utilizando 160 µl de ácido acético glacial al 33 % (v/v) por pocillo.

Se usó un lector automático (ICN Flow Titertek Multiscan Plus) para medir las medidas de OD en los pozos. Las lecturas se tomaron en tres momentos diferentes: primero, antes de que se incubaran las muestras (OD 600 nm); segundo, post-incubación para evaluar el crecimiento (OD 600 nm); y tercero, después de completar la prueba de biopelícula (OD 570 nm). Se utilizó una proporción de 570/600 para normalizar la medición de la formación de biopelículas frente al crecimiento bacteriano. Los valores de DO negativos se mostraron como cero. Cada experimento se realizó tres veces y se determinó un valor de corte (ODc) a partir de las desviaciones estándar (SD). La DOc utilizada fue la media del control negativo + 3 DE. Luego, los aislamientos se asignaron a cuatro categorías de productores de biopelículas de la siguiente manera: no productor (OD < ODc); productor débil (ODc < OD < 2 × ODc); productor moderado (2 × ODc < OD < 4 × ODc); y productor fuerte (4 × ODc < OD).

La actividad metabólica se evaluó en la segunda placa usando TTC como marcador para el crecimiento bacteriano viable. Las células metabólicamente activas convierten el TTC en un derivado de formazán que es fácil de medir colorimétricamente. De manera similar a los experimentos de crecimiento, las placas se agitaron vigorosamente para eliminar cualquier bacteria que no se hubiera adherido después de la incubación durante 24 h a 37 °C.

Se eliminó el medio de todos los pocillos después de la incubación y se usaron 200 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar la biopelícula. Las células de biopelícula de los pocillos con biopelícula se pipetearon vigorosamente en la suspensión después de agregar 100 μl de solución de PBS. A continuación, la biopelícula suspendida se trasladó a una microplaca de fondo plano de 96 pocillos nueva.

Se obtuvo una concentración final de 0,02% al agregar 50 μl de TTC al 0,1% (Sigma, EE. UU.). Las muestras se dejaron incubar a 37 °C durante 4–5 h, después de lo cual se midió la DO405 con un lector de microplacas VERSA max. La absorbancia colorimétrica a 405 nm es un medio eficaz para cuantificar la inhibición del crecimiento bacteriano, ya que se produce formazán rojo cuando las bacterias viables reducen el TTC36.

Para evaluar el impacto de las NP de Ag en la producción de EPS, se utilizó un método modificado de precipitación con etanol37. La extracción de EPS de cada cepa se realizó por triplicado. Se preparó una suspensión bacteriana de 0,5 McFarland de cada cepa en caldo LB y se añadió en 100 ml de caldo LB con Ag NP en un rango de concentraciones de 7,5 a 0,225 μg/ml y se incubaron a 37 °C durante 24 h. El control se preparó sin la adición de Ag NP. Después de la incubación, se extrajo el EPS de los cultivos bacterianos mediante centrifugación a 10 000 rpm durante 30 min a 4 °C. Para precipitar el EPS, se agregó 1 volumen de etanol al 95 % a cada 3 volúmenes del sobrenadante recolectado de la centrífuga y se colocó en refrigeración a 4 °C durante 18 h. A continuación, la mezcla se centrifugó de nuevo a 10.000 rpm durante 20 min mientras se mantenía la temperatura a 4 °C. El EPS precipitado se recogió y se volvió a suspender con agua bidestilada. Cualquier rastro de células bacterianas se eliminó de la suspensión mediante filtración usando una membrana de acetato de celulosa de 0,45 μm. Para confirmar la ausencia de bacterias viables, se colocó una muestra en una placa de agar en condiciones de cultivo óptimas para comprobar el crecimiento. A continuación, el EPS extraído se liofilizó y se pesó para dar un resultado en mg de EPS por 100 ml.

Se utilizó una técnica que combina la tinción de CV34,35 con un colorante de tetrazolio sensible al metabolismo para evaluar el impacto de las NP de Ag en las biopelículas preformadas. Se crearon suspensiones bacterianas estandarizadas mediante cultivo durante la noche en dos placas de 96 pocillos con TSB a una concentración de 0,5 McFarland. Se produjeron biopelículas añadiendo alícuotas de 20 µl de suspensión bacteriana a alícuotas de 250 µl de TSB (sin Ag NP). Luego, las placas se dejaron incubar durante la noche a 37 °C para permitir que la biopelícula creciera y se adhiriera a las placas.

Se crearon dos pozos separados para cada condición en placas de microtitulación individuales, uno para teñir con CV y ​​el otro para teñir con TTC metabólico. El medio se retiró de la placa al día siguiente y se dejó secar durante 15 min sobre una toalla de papel a temperatura ambiente. Después de eliminar las células planctónicas y no adheridas, se usó una pipeta multicanal para enjuagar la biopelícula adherida. Este proceso se realizó tres veces utilizando 150 µl de medio estéril. Se aspiró el exceso de medio de lavado de cada pocillo antes de añadir 200 µl de MHB fresco que contenía las diferentes concentraciones de Ag NP. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. El crecimiento planctónico se examinó al día siguiente, después de lo cual se retiraron las células planctónicas y los medios utilizados, y la biomasa residual se lavó tres veces en agua destilada. A continuación, una placa se tiñó con CV y ​​la otra con TCC. A continuación, se obtuvieron valores medios de DO490 a partir de los resultados de las tres réplicas biológicas independientes36.

Se realizó una prueba qRT-PCR para estimar el impacto de concentraciones altas (7,5 µg/ml) y bajas (0,45 µg/ml) de Ag NP en la expresión de genes reguladores de QS. PA se incubó en medio MH con Ag NP a 37 ° C y 50–60 rpm en placas de 6 pocillos (Corning, NY). Los controles se incubaron en condiciones idénticas pero sin Ag NP. Después de la exposición durante 24 a 48 h (fase exponencial de crecimiento de biopelícula), la biopelícula se cosechó cuidadosamente y se enjuagó suavemente con NaCl 10 mM para eliminar las células sueltas. El ARN del biofilm se extrajo con el kit RNeasy Mini (Qiagen, Alemania).

Para sintetizar el ADNc, los cebadores aleatorios (incluidos RNaseOUT, dNTP y la transcriptasa inversa Superscript II (Tsingke, Beijing, China) se sometieron a una reacción de PCR de transcripción inversa a 42 °C. Las reacciones cuantitativas en cadena de la polimerasa (qPCR) se llevaron a cabo utilizando un BIO-RAD Thermal Posteriormente, se agregaron 2 μl de ADN molde a una solución de 0,5 μl de cada cebador directo e inverso, 10 μl de Luna Universal qPCR Master Mix y 7 μl de agua libre de nucleasas para dar un volumen de reacción final de 20 μl .

Se realizó una reacción de PCR en gradiente para todos los cebadores de PCR utilizados en este estudio. Las condiciones de ciclado fueron sometidas a predesnaturalización a 95 °C por 3 min, luego de lo cual se realizaron 34 ciclos de desnaturalización a 94 °C, cada uno por treinta segundos, y recocido a un rango de temperatura entre 50 y 63 °C por treinta segundos. . Esto fue seguido por elongación a 72 °C durante 60 s. Finalmente, la reacción se prolongó durante 5 min a una temperatura de 72 °C. Los valores de expresión relativa de los genes reguladores de QS se normalizaron con respecto a los genes de mantenimiento rpoD y rpsL, y la amplificación por PCR específica se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa. Para el PA tratado, el nivel de expresión génica se calculó en relación con el del PA no tratado. Para ello se empleó la técnica 2−ΔΔCt38. Las secuencias de cebadores utilizadas en esta investigación se presentan en la Tabla complementaria 1.

La línea celular HT29-MTX se utilizó para evaluar la citotoxicidad de las NP de Ag mediante el ensayo de metil tetrazolio (MTT)39. HT29-MTX se origina en las células caliciformes del colon, pero secreta la mucina MUC5AC, característica de las células caliciformes que se encuentran en las células del sistema respiratorio, en lugar de la mucina MUC2 característica de las células caliciformes del colon. Las células HT29-MTX se cultivaron en matraces T75 con CO2 al 10 % a 37 °C en 12 ml de medio Eagle modificado por Dulbeco (DMEM, Sigma, Reino Unido) con la adición de FCS al 10 % (Sigma, Reino Unido), 50 U/ml de penicilina, estreptomicina 50 mg/ml (Sigma, Reino Unido), gentamicina 50 mg/ml (Lonza, EE. UU.) y anfotericina B 50 µg/ml (Lonza, EE. UU.).

A continuación, las células HT29 MTX se dejaron en reposo durante 24 h en DMEM sin suero que contenía 50 U/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 50 µg/ml de anfotericina B. A continuación, se añadieron Ag NP a concentraciones de 7,5 –0,225 µg/ml. Las células tratadas con Ag NP y las células de control se incubaron durante 24 h con 5 % de CO2 a una humedad relativa del 95 %. A continuación, se retiró el medio y se lavaron las células con PBS. A continuación, se añadieron a los pocillos 25 ml de solución de MTT (5 mg/ml) y se incubaron durante 4 h. El medio se retiró y se reemplazó con 100 ml de DMSO y se agitó suavemente durante 15 min. Para evaluar el efecto de las Ag NP en la viabilidad celular, se usó el lector de placas de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para medir la absorbancia a 570 nm y el porcentaje de células viables estimado para las células control y tratadas con Ag NP38.

El Comité de Servicios de Ética de la Universidad Hachemita y el Hospital Prince Hamza otorgaron la aprobación ética para este estudio de caso (número de referencia 7/10/2019-2020). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Los aislados clínicos de AP de las muestras de esputo se tomaron después de obtener el consentimiento informado de todos los pacientes con FQ.

Se utilizaron la media (M) y el error estándar de la media (SEM) de al menos tres repeticiones para expresar los resultados experimentales. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional para identificar las diferencias entre las muestras y los controles. Los valores de DO de los experimentos con placas de microtitulación (con y sin nanopartículas) en varias diluciones se compararon mediante la prueba de Tukey. Los valores de p por debajo de 0,05 se consideraron significativos. Los datos se examinaron usando el software Graphpad Instat 6.0.

Durante la preparación de Ag NP, la formación de Ag NP provoca un cambio de color en la mezcla de reacción de naranja a marrón oscuro, lo que indica una reducción de AgNO3 a partir de la excitación de la resonancia de plasmón superficial (SPR) en las Ag NP (Figura complementaria 2). El espectro UV-Vis (que se muestra en la Fig. 1A) revela un amplio pico de absorción alrededor de 461 nm, lo cual es consistente con la resonancia de plasmón superficial de Ag que ocurre entre 450 y 500 nm.

(A-E) El espectro UV-visible de las Ag NP sintetizadas (A). Las imágenes STEM para Ag NP sintetizadas, aumento a 300 × (B) y a 200 nm (C). Los histogramas de tamaño de las Ag NP (D), el patrón XRD de las Ag NP sintetizadas (E).

La imagen STEM para las Ag NP que se sintetizaron con extracto de semilla de P. harmala se puede ver en la Fig. 1. La imagen de campo oscuro en la Fig. 1B muestra que se biosintetizaron Ag NP con un tamaño de partícula promedio de aproximadamente 11 nm. Además, la imagen de campo brillante para Ag NP que se muestra en la Fig. 1C destaca la uniformidad de las partículas sintetizadas, su forma esférica y la falta de agregación. Los histogramas de tamaño de las Ag NP se muestran en la Fig. 2D. Los histogramas indican que los principales tamaños de partículas de las Ag NP realizadas en esta investigación son de aproximadamente 10,9 ± 2,7 nm.

Los espectros FT-IR: (A) extracto de P. harmala. (B) Ag NP sintetizadas.

El patrón XRD de la muestra de nanopartículas de plata cebada previamente se documentó en el Consorcio para la Investigación Científica UGC-DAE, Indore. Para ello se utilizó un difractómetro de rayos X Bruker d8 Advance. Se aplicaron los siguientes parámetros: fuente de radiación, CuKα, λ = 1.5406 Å; 40 kV–40 mA; modo de exploración, 2θ/θ.

Se hizo una comparación entre el difractograma, que se muestra en la Fig. 1, y la tarjeta de difracción de potencia estándar JCPDS, archivo de plata No. 04-0783. Se reconocieron cuatro picos en valores de 2θ, es decir, 38,2901°, 44,5583°, 64,8185° y 77,4383°, que se consideró que reflejaban el metal plateado y los valores del plano plateado asociado de hkl, es decir, (111), (200), (200 ) y (311), respectivamente. En la figura 1D.

Se utilizó FT-IR para identificar las interacciones que tienen lugar entre los átomos de Ag y los productos químicos bioactivos que afectan la estabilidad de las NP de Ag (Fig. 2). Se pueden ver picos de espectros FT-IR similares con un ligero cambio en los extractos de P. harmala y NP de Ag biosintetizados. En la Fig. 2A,B, los diferentes colores de flecha representan diferentes grupos funcionales. El amarillo denota el pico en 3533,98 cm-1 para el espectro del extracto de P. harmala, que cambió a 3318,33 cm-1 para el espectro del extracto de Ag NP y se asignó al estiramiento OH de los grupos hidroxilo, incluidos los alcoholes, fenoles y el grupo NH de aminas o amidas. El rojo representa el pico en 1608,36 cm−1 para el espectro del extracto de P. harmala que cambió a 1629,49 cm−1 para el espectro del extracto de Ag NP y se asignó al grupo C=O de ácidos carboxílicos. Finalmente, la flecha verde indica el pico para el espectro del extracto de P. harmala en 725,87 cm−1 que cambió a 888,70 cm−1 para el espectro del extracto de Ag NPs y se asignó a C=CH2.

La susceptibilidad a los antibióticos se evaluó mediante el método de difusión en disco. Cuatro aislados clínicos (PA2, PA4, PA6 y PA5) demostraron resistencia intermedia a uno (gentamicina), dos (imipenem y levofloxacino), cuatro (imipenem, gentamicina, levofloxacino y ciprofloxacino) y cinco de los antibióticos empleados en este ensayo (meropenem, Gentamicina, Amikacina, Levofloxacina y Ciprofloxacina) respectivamente. Se encontró que tres aislados clínicos (PA3, PA5 y PA6) eran resistentes a la cefepima. Sin embargo, es importante señalar que ninguno de los aislamientos fue resistente a múltiples fármacos (MDR). La Tabla complementaria 2 muestra los resultados de las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos para ATCC y las cepas clínicas, con PA5 que tiene la mayor resistencia a todos los antibióticos estudiados.

Después de que las muestras se incubaran a 37 °C durante 24 h en condiciones aeróbicas y con Ag NP en concentraciones que oscilaban entre 3,9 y 1000 μg/ml, se observó turbidez en los tubos de ensayo que contenían 3,9–7,8 µg/ml de Ag NP. Esta turbidez indicó que las bacterias estaban creciendo a estas concentraciones de Ag NP. Sin embargo, no se pudo observar turbidez en concentraciones de 15,6 a 1000 µg/ml, lo que indica que se había inhibido el crecimiento bacteriano. Se inocularon placas de agar BHI con las suspensiones de los tubos de 15,6–1000 µg/ml durante un período de 24 h. No se observaron bacterias a concentraciones de 31,25–1000 µg/ml, lo que verifica que las NP de Ag eran bactericidas. Por lo tanto, a partir de estos hallazgos es evidente que la MIC y la MBC de las NP de Ag para todas las cepas de PA fueron 15,6 y 31,25 µg/ml, respectivamente.

Los ensayos de placas de microtitulación mostraron que todas las cepas eran fuertes productoras de biopelículas (consulte la Tabla complementaria 3 para obtener más detalles). Se utilizaron NP de Ag en concentraciones que oscilaban entre 0,225 y 7,5 µg/ml para evaluar la actividad antibacteriana de las NP de Ag contra las cepas de PA (cepa de referencia y seis cepas clínicas) con resistencia a varios antibióticos. A pesar de la variación entre las diferentes cepas, la incubación de cepas PA con Ag NP en dosis que oscilaban entre 0,22 y 7,5 g/ml tuvo un efecto adverso sobre el crecimiento (Fig. 3). En concentraciones de 0,9 a 7,5 µg/ml, se encontró que las NP de Ag generaban una disminución significativa en el crecimiento (P < 0,05) en cuatro de las cepas de PA (ATCC, PA1, PA2, PA6). Las cepas PA3, PA4 y PA5 se vieron significativamente afectadas a concentraciones superiores a 1,8 µg/ml (F (3,013, 11,08) = 61,93, P < 0,0001). Las concentraciones por debajo de este afectaron negativamente el crecimiento en todas las cepas, aunque esto no fue estadísticamente significativo. Sin embargo, a 0,225 µg/ml hubo un aumento en el crecimiento de ciertas cepas de PA (ATCC, PA1, PA5 y PA6).

El impacto de las NP de Ag en el crecimiento planctónico de PA después de 24 h de incubación indicado por la absorbancia a 600 nm (eje y) para la cepa ATCC y seis cepas clínicamente aisladas (PA1–PA6) a concentraciones de NP de Ag de 0,22 a 7,5 µg/ ml (eje x). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

El desarrollo de biopelículas de tres cepas (ATCC, PA2, PA6) se vio significativamente afectado por Ag NP en concentraciones de 0,45 µg/ml o superiores (F (1,931, 11,39) = 17,12, P = 0,0009). Solo las concentraciones de 0,9 µg/ml y superiores afectaron sustancialmente a PA1 y PA3. Las concentraciones de 1,8 µg/ml o más redujeron significativamente la formación de biopelículas de las cepas más resistentes de PA4 y PA5 (Fig. 4).

El impacto de las Ag NP en el desarrollo de biopelículas para la cepa ATCC y seis cepas clínicamente aisladas (PA1-PA6) después de la incubación durante 24 h a concentraciones de Ag NP de 0,22 a 7,5 µg/ml (eje x). ****< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

El análisis del metabolismo de PA en biopelículas reveló una disminución estadísticamente significativa en los niveles de PA en comparación con el control (F (2,757, 16,94) = 43,30, P < 0,0001) (Fig. 5). El metabolismo celular del biofilm de TCC, ATCC, PA1, PA2 y PA6 se inhibió significativamente con 0,9 µg/ml de NP de Ag. Se observaron efectos significativos sobre PA3 y PA4 a concentraciones de 1,8 µg/ml y superiores. Solo se encontró que la cepa PA5 se vio significativamente afectada en concentraciones superiores a 3,75 µg/ml. No obstante, la actividad metabólica de las células del biofilm de PA5 se vio significativamente afectada en todas las concentraciones de Ag NP.

Impacto de las NP de Ag en la actividad metabólica de las células planctónicas PA, indicado por la absorbancia a 600 nm (eje y) 4 h para la cepa ATCC y seis cepas clínicamente aisladas (PA1-PA6) a concentraciones de NP de Ag de 0,22 a 7,5 µg /ml (eje x). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

En comparación con las cepas hospitalarias, la cepa de referencia demostró una mayor sensibilidad a todas las concentraciones de Ag NP examinadas. Las concentraciones más bajas de Ag NP necesarias para impactar significativamente en la cepa ATCC respaldan los hallazgos de los ensayos de antibióticos, donde se encontró que era sensible a todos los antibióticos probados.

El efecto de las NP de Ag sobre la producción de EPS se examinó cultivando las cepas de PA sin NP de Ag o con concentraciones subinhibitorias de NP de Ag. El peso seco del EPS extraído después del cultivo fue significativamente menor en las células tratadas con Ag NP que en las células de control (F (6, 42) = 8,38, P ≤ 0,0001). La Figura 6 muestra que el peso de EPS extraído de PA ATCC, PA1, PA3 y PA6 fue significativamente menor que el del control cuando crecieron en presencia de concentraciones de NP de Ag iguales o superiores a 0,9 µg/ml. Para PA2, PA4 y PA5, las reducciones en la producción de EPS fueron estadísticamente significativas a concentraciones de NP de Ag iguales o superiores a 1,8 µg/ml.

Impacto de las Ag NP en la producción de EPS del biofilm, indicado por el peso seco de EPS (mg/100 ml) para la cepa ATCC y los seis aislados clínicos (PA1-PA6) a concentraciones de Ag NP de 0,22 a 7,5 µg/ml (eje x ). ****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01.

Los resultados indican que las Ag NP también redujeron significativamente la biomasa de PA teñida con CV en los ensayos de erradicación que evaluaron el tratamiento de biopelículas preformadas de 1 día de antigüedad (F (20, 66) = 9,148, P = 0,0001). Al mismo tiempo, las NP de Ag inhibieron la actividad metabólica de las biopelículas maduras. La Figura 7 muestra que dos de las cepas (ATCC, PA6) mostraron disminuciones estadísticamente significativas en la biomasa de tinción de CV a concentraciones superiores a 0,9 µg/ml. Tres cepas (PA1, PA2, PA3) también fueron significativamente inhibidas por una concentración de Ag NP de 1,8 µg/ml. La tinción CV sustancial de PA4 y PA5 se redujo significativamente en concentraciones superiores a 3,75 µg/ml.

Impacto de las Ag NP en la erradicación del biofilm maduro después de 24 h de incubación a concentraciones de 0,22 a 7,5 µg/ml (eje x) indicado por OD a 570 nm (eje y). (****0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

El metabolismo de la comunidad de biopelículas preformadas de las cepas de PA incubadas con Ag NP se inhibió significativamente (F (6, 7) = 15,32, P = 0,001). En las cepas PA2 y PA3, las concentraciones de Ag NP de 0,9 µg/ml inhibieron significativamente la actividad metabólica, pero se necesitaron concentraciones de 1,8 µg/ml o superiores para inhibir significativamente la actividad metabólica de ATCC, PA1, PA5 y PA6. Solo las concentraciones de 3,75 µg/ml y superiores afectaron significativamente la actividad metabólica de PA4 (Fig. 8).

Impacto de las NP de Ag en la actividad metabólica de células maduras de biopelícula mediante tinción con TCC después de 24 h de incubación con concentraciones de NP de Ag de 0,22 a 7,5 µg/ml (eje x). Esto se denota por OD a 570 nm (eje y) (< 0,0001, ***0,0001, **< 0,001, *< 0,01).

Los valores de Ct calculados se usaron para determinar las expresiones correspondientes de los genes regulados por QS lasI, lasR, rhlI, rhlR, pqsR y pqsA. Las expresiones génicas primero se estandarizaron en relación con el promedio del gen de referencia RopD. La Figura 9 compara la expresión relativa de genes regulados por QS en la cepa PA expuesta a Ag NP biosintetizados (a concentraciones de 7,5 µg/ml y 0,45 µg/ml) con las muestras de control cultivadas sin Ag NP. Como muestra la Fig. 7, las NP de Ag reducen la expresión de genes reguladores de QS. En comparación con el control, donde se supone que la expresión génica es del 100 %, todas las cepas de PA, excepto dos, cultivadas con 7,5 µg/ml de Ag NP durante 24 h muestran expresiones génicas reguladas por QS significativamente reducidas. Las dos excepciones (LasR en PA3 y LasI de PA4) mostraron reducciones en la expresión, pero esto fue estadísticamente insignificante.

El efecto de Ag NP en la expresión de genes regulados por QS en cepas de PA expuestas a Ag NP biosintetizadas en relación con la expresión génica de controles no expuestos a Ag NP. Concentraciones de Ag NP de 7,5 µg/ml y 0,45 µg/ml. *< 0,01.

El porcentaje de inhibición varió entre cepas y entre diferentes genes (Cuadro 1). En comparación con la muestra de control, a 7,5 µg/ml de Ag NP, la expresión relativa del sistema del gen Las se redujo notablemente en todas las cepas. La disminución de LasR, LasB y LasI fue entre 25,7 y 63,3%, 13,2 y 51,4% y 15,7 y 69,4%, respectivamente. A concentraciones de 7,5 µg/ml, la expresión génica de rhIR y rhII mostró disminuciones estadísticamente significativas, que oscilaron entre el 19,7 y el 43,8 % y entre el 16 y el 40,3 %, respectivamente. Además, a la concentración alta, la expresión de PqsA y PqsR se redujo sustancialmente en comparación con los controles.

A la concentración de Ag NP de 0,45 µg/ml, también hubo algunos efectos estadísticamente significativos sobre la expresión relativa de ciertos genes. Los genes del sistema Las fueron los más afectados, con la expresión relativa del gen LasR reducida estadísticamente en 4 cepas (ATCC, PA1, PA2 y PA 6). La expresión del gen LasI se redujo significativamente en ATCC y PA1, mientras que LasB solo mostró una reducción significativa en PA1. No hubo un impacto estadísticamente significativo de la concentración de Ag NP de 0,45 µg/ml en el sistema RhI y pqs aparte de la expresión del gen rhII en PA3.

Los ensayos de MTT se utilizaron para el cribado inicial de la citotoxicidad de Ag NP en las líneas celulares de cáncer HT29-MTX. La línea celular HT29-MTX mostró una alta resistencia a las NP de Ag en todas las concentraciones utilizadas, sin reducciones estadísticamente significativas en la viabilidad celular (F (6, 14) = 0,2871, P = 0,9334). No obstante, la viabilidad celular se redujo del 4,1 % a una concentración de Ag NP de 7,5 µg/ml al 0,2 % a 0,225 µg/ml (Fig. 10).

La influencia de diferentes concentraciones de Ag NP en la viabilidad de la línea celular humana HT29-MTX después de 24 h de incubación. La viabilidad celular relativa se comparó con el control (probado/control × 100). El experimento se realizó 3 veces por duplicado.

Los microbios formadores de biopelículas son responsables de muchas enfermedades. Un estudio realizado por los Institutos Nacionales de Salud y el Centro de Control de Enfermedades encontró que los microbios formadores de biopelículas causaron entre el 65 y el 80 % de las infecciones40. Muchos estudios han indicado que las NP sirven como inhibidores de biopelículas eficaces contra las bacterias diana41,42. Además, en trabajos anteriores descubrimos que las nanopartículas de ZnO desempeñaban un papel fundamental para contrarrestar el desarrollo de biopelículas en PA43 que forma biopelículas. El estudio actual se centró en el uso de P. harmala en la síntesis de Ag NP, ya que se pensaba que tenía beneficios tanto biológicos como económicos. Los resultados destacan las importantes propiedades anti-QS, antibacterianas y antibiofilm de las NP de Ag biosintéticas.

La reducción química es uno de los procesos utilizados para crear Ag NP44,45. Se cree que los enfoques de reducción son más simples y asequibles que otros métodos alternativos46. Además, se recomienda enfáticamente que se utilicen técnicas ecológicas para sintetizar Ag NP (es decir, enfoques de síntesis verde que involucran tanto plantas como microorganismos)47. En el estudio actual, se utilizaron agentes reductores de metabolitos secundarios de plantas para crear las NP48. Las NP de Ag se han biosintetizado usando una variedad de plantas y se han evaluado varios procesos biológicos. En el presente trabajo se utilizó Pharmala, una hierba que posee muchos constituyentes fitoquímicos que han sido ampliamente aplicados en la medicina tradicional49.

Nuestro estudio reveló que durante la biosíntesis, las Ag NP comienzan a desarrollarse cuando el nitrato de plata se expone al extracto de semilla de P haramla. Esto se confirmó mediante cambios de color y el uso de espectroscopia UV-Vis. Las Ag NP biosintetizadas mostraron una fuerte banda de absorción a 461 nm como resultado de sus características SPR. La reducción y la estabilidad de las nanopartículas de plata pueden ser causadas por interacciones entre los átomos de plata y los productos químicos bioactivos50, y esto se investigó mediante el análisis FT-IR. Picos similares fueron evidentes en los espectros FT-IR del extracto de P. harmala utilizado para sintetizar las Ag NP, aunque también hubo pequeños cambios en ambos espectros. Los espectros de las Ag NP basadas en extractos de semillas revelaron un rango de bandas de absorción entre 1642 y 3351 cm−1. Esto indica que la biomolécula tiene la capacidad de reducir y estabilizar los iones de plata (Ag+, Ag0) en las NP de Ag cuando se coloca en extracto acuoso de semillas.

La detección adicional de TEM reveló que estas partículas tenían una forma aproximadamente esférica y un tamaño uniforme, con un diámetro promedio de 11 nm. Las propiedades antibacterianas de las Ag NP se correlacionan negativamente con el tamaño de sus partículas, siendo más débiles cuanto mayor es el diámetro51. Según Choi et al.52, las NP de Ag menores de 15 nm pueden ingresar a la bacteria y ejercer efectos antibacterianos sustancialmente más potentes que las de 15 a 20 nm. Las partículas de 1 a 15 nm pueden adherirse a la superficie de la bacteria.

Utilizamos nuestros Ag NP para probar su eficacia bactericida contra PA. Nuestros hallazgos demostraron que las Ag NP tenían un potente efecto antibacteriano sobre la PA en bajas concentraciones, con MIC y MBC entre 15,6 y 31,25 µg/ml, respectivamente. Se ha informado que la MIC de Ag NP para PA es de 0,59 a 50 µg/ml53,54,55,56,57,58,59,60. La amplia gama de valores de MIC encontrados en diferentes estudios se debe a que las diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas (es decir, forma, tamaño y presencia de restos superficiales) tienen un impacto sustancial en su actividad antibacteriana51. El MIC de nuestras Ag NP es consistente con el rango más bajo de los MIC conocidos, y esto probablemente se deba a su tamaño de partícula relativamente pequeño. Por lo tanto, pudimos prevenir de manera eficiente el crecimiento de PA utilizando una baja concentración de Ag NP. El efecto inhibidor de las NP de Ag sobre Escherichia coli (E. coli) y Staphylococcus aureus (S. aureus) fue estudiado por Azizi et al.60, quienes también las sintetizaron utilizando P. harmala. Si bien las NP de Ag producidas eran más grandes (23 nm), mostraron una acción inhibidora moderada, lo que nuevamente demuestra la eficacia de las NP de Ag contra las bacterias patógenas. Sin embargo, estos autores no investigaron los efectos de Ag NP sobre PA.

La prueba de la placa de microtitulación también se llevó a cabo en este estudio para examinar la inhibición de la formación de biopelículas en PA en presencia de diferentes concentraciones de Ag NP. Los hallazgos mostraron que, de hecho, hubo una inhibición estadísticamente significativa de la formación de biopelículas (Figs. 3, 4), así como una reducción de EPS (Fig. 6). Nuestros hallazgos están en línea con estudios anteriores realizados por Haidari et al.61, quienes investigaron el impacto de las NP de Ag en la producción de biopelículas en varias bacterias y descubrieron que las NP de Ag en una concentración de 45 µg/ml pueden inhibir la formación de biopelículas de S aureus en un 89% y de E. coli en un 75%.

Loo et al.62 también demostraron la eficacia de las NP de Ag (tamaño de 7 a 70 nm) contra la cepa PAO1 de PA ATCC, quienes demostraron que la descomposición de la matriz de EPS resultó en una reducción del 95% en la generación de biopelícula por PA. Las Ag NP pueden causar un daño estructural significativo a las biopelículas bacterianas. Esto se puede ver en la morfología modificada de las biopelículas como resultado de la lisis celular14, el daño de la pared celular y la interrupción de la ondulación de la membrana y la polarización/permeabilidad de la membrana. Ciertas cepas de bacterias también forman matrices específicas de EPS que las encierran15. Las Ag NP interactúan electrostáticamente con las membranas bacterianas y esto puede ser lo suficientemente fuerte como para romper las membranas y permitir que las NP penetren en la biopelícula madura. Sin embargo, un estudio realizado por Haney et al.63 fue contrario a nuestros hallazgos y encontró que el tratamiento de células con nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético a una dosis de 200 µg/ml aumentaba la biomasa de la biopelícula de PA. Este efecto se explicó por el hecho de que las células pueden emplear nanopartículas de hierro para proporcionar hierro elemental, lo que lleva al aumento observado en la densidad celular y al desarrollo de biomasa de biopelículas, un proceso que no está disponible en el caso de Ag NP.

En nuestro estudio, las Ag NP pudieron reducir la biomasa de biopelículas establecidas. Sin embargo, se requieren concentraciones más altas para lograr una reducción estadísticamente significativa que la necesaria para impactar significativamente la formación temprana de biopelículas, lo que refuerza la opinión de que la función principal de las biopelículas es protectora64,65. Según Said et al.65, cuando el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y el cloruro de bencetonio (BC) rompen la matriz del biofilm, las células del biofilm son mucho más susceptibles a las NP de Ag (medidas mediante microcalorimetría).

Nuestros hallazgos mostraron que las NP de Ag redujeron la actividad metabólica de PA en biopelículas maduras, lo cual está en línea con los mecanismos de acción propuestos por Li et al.66 y Kim et al.67. Las NP de Ag tienen la capacidad de ingresar a las células y atravesar su peptidoglucano, periplasma y membranas externas. Aquí es donde destruyen las deshidrogenasas de la cadena respiratoria y modifican el nivel de oxígeno disuelto66,67. Además, podrían tener lugar interacciones entre Ag+ y el grupo de cisteínas tiol (–SH) para generar –S–Ag. A su vez, esto inhibiría el desarrollo y suprimiría la actividad enzimática de las células bacterianas66,68.

La patogenicidad bacteriana y la capacidad de formación de biopelículas están controladas por la red QS69, que contiene reguladores transcripcionales activados por sus autoinductores naturales (es decir, las y rhl22). Además de regular los rasgos de virulencia, QS también gestiona la capacidad de formación de biopelículas de PA. Los estudios de Solano et al.70 y Brindhadevi et al.69 demostraron que la AP con lasR y lasI mutados crean biopelículas que son menos eficaces y pueden eliminarse fácilmente con antimicrobianos. Los exopolisacáridos y otras sustancias que regulan la forma de las comunidades en crecimiento están codificados por genes que QS activa40.

Varios sistemas desempeñan un papel en la co-regulación de la formación de biopelículas en el sistema PA general, incluidos los sistemas las, rhl y pqs. Mientras que LasI y RhlI regulan la síntesis de autoinductores, lasR y rhlR participan principalmente en la codificación de activadores transcripcionales71. Las NP de Ag pueden interferir con las vías las y rhl e impedir la producción de moléculas de señalización, evitando la formación de biopelículas en PA debido al impacto anti-QS64,72. En el presente trabajo, cuando las células bacterianas se trataron con Ag NP, la expresión de muchos genes importantes de los sistemas QS las, rhl y pqs (lasR, lasI, lasB, rhlI, rhlA, pqsR y pqsA) disminuyó significativamente. en comparación con el control (Fig. 9 y Tabla 1).

Se sugirió que las Ag NP pueden interrumpir el sistema QS primario de PA. No obstante, es importante tener en cuenta que el desarrollo de biopelículas es un proceso dinámico, y la producción de QS sigue a la unión bacteriana irreversible, así como a la multiplicación y expansión celular posterior a la inoculación. Como resultado, durante las primeras etapas del desarrollo del biofilm, el impacto inhibidor de las Ag NP en las biomasas del biofilm a través de la interferencia con el sistema QS fue distinto en la formación temprana del biofilm a concentraciones de Ag NP más bajas que las necesarias para efectuar el biofilm establecido.

Actualmente, se cree que las NP de Ag funcionan alterando la integridad y la membrana de las paredes celulares bacterianas, aumentando la permeabilidad de la membrana y promoviendo la muerte celular73. Además, las NP de Ag interrumpen la reacción en cadena respiratoria al combinarse con grupos sulfhidrilo, lo que provoca la peroxidación de lípidos y facilita el daño oxidativo al ADN y las proteínas relevantes, tras lo cual se produce la muerte celular74,75. Las NP de Ag también se adhieren a grupos de ADN sulfurosos y fosforosos, que en última instancia pueden dañar el ADN e interferir con su transcripción y traducción76. Además, las NP de Ag interrumpen la transducción de señales celulares e inician la muerte celular a través de la desfosforilación de fosfotirosinas77. Cuando las NP de Ag se exponen a condiciones aeróbicas, pueden liberar Ag+ de la superficie de las partículas. El Ag+ liberado tiene un efecto antimicrobiano significativo ya que interactúa con las paredes celulares y las membranas de las bacterias. Esta es una de las razones clave de la toxicidad de las NP de Ag78.

Aunque las Ag NP tienen un gran potencial para servir como agentes antimicrobianos, existen preocupaciones con respecto a su seguridad en humanos y el desarrollo de resistencia a la plata en bacterias, incluida Pseudomonas. El potencial citotóxico de las NP de Ag ha impedido su establecimiento como agentes quimioterapéuticos prometedores. Siddique et al.79 examinaron el potencial tóxico de las NP de Ag contra las líneas celulares HeLa en varias concentraciones mediante la prueba de absorción de rojo neutro. Sus resultados encontraron que estas NP no eran tóxicas hasta concentraciones de 120 μg/ml, y que se producen efectos citotóxicos estadísticamente significativos a una concentración de 240 μg/ml, una concentración más alta que la utilizada en nuestro presente trabajo. Además, la concentración tóxica de NP de Ag oscila entre 10 y 100 µg/ml en estudios que han evaluado el impacto de las NP de Ag en cultivos de células humanas in vitro80,81,82. En nuestro trabajo, no se encontró una inhibición estadísticamente significativa cuando desafiamos la línea celular HT29-MTX con las Ag NP biosintetizadas en concentraciones similares, lo que sugiere que las Ag NP podrían ser seguras si se usan en cantidades bajas.

La aparición de resistencia bacteriana a la plata a través de la transferencia horizontal de genes de las bacterias83 es ​​una preocupación grave que ha surgido debido al uso cada vez mayor de la plata en la medicina y la industria, así como en los antimicrobianos domésticos. Algunos estudios han demostrado que PA84 y otras especies de bacterias85,86 son capaces de reducir Ag+ soluble a Ag coloidal o NP Ag0, a través de un proceso de reducción aún desconocido12. Muller y Merrett86 han propuesto que las bacterias eliminan el Ag+ del entorno circundante antes de que pueda penetrar en la célula, lo que reduce la necesidad de procesos de unión a proteína y plata y de eflujo celular. El efecto destructivo e inhibidor de la plata sobre las biopelículas no evita por completo que las biopelículas se adapten a la plata tanto en forma de NAg como de Ag+ iónico. No obstante, en comparación con los antibióticos de uso común, la plata sigue siendo un agente antibiopelícula eficaz87,88.

Al examinar el impacto bactericida de las Ag NP, ciertas cepas de PA mostraron un aumento inesperado en el crecimiento a concentraciones más bajas (Fig. 3). En trabajos anteriores, se encontró que las concentraciones de AgNO3 por debajo de los niveles bactericidas (3–8 µg/l) estimulan, en lugar de inhibir, el crecimiento de E. coli89. Hallazgos similares obtuvieron Schacht et al.90, donde NPs de Ag menores de 15 nm y en concentraciones entre 20 y 60 µg/ml estimularon el crecimiento de algunas bacterias. Xiu et al. demostraron Ag NP con un tamaño de 2,8 a 10,5 nm y recubiertas con polietilenglicol. 89 para aumentar el crecimiento de E. coli K12 del 6 al 13 % en concentraciones de 1,8–2,2 µg/ml. Los autores también encontraron Ag NP con un tamaño de 20 a 80 nm y recubiertas con polivinilpirrolidona para aumentar el crecimiento de E. coli del 11 al 21 % en concentraciones de 5,7 a 16,4 µg/ml.

El crecimiento aumentado o estimulado de organismos bajo exposición subletal a agentes inhibidores es una respuesta bifásica a la dosis conocida como respuesta hormética. El patrón de respuesta característico de los microbios es de crecimiento estimulado a bajas concentraciones del inhibidor y crecimiento inhibido a altas concentraciones 91. Los estudios de los efectos de los antibióticos en bacterias que han visto respuestas horméticas han concluido que representan un nuevo mecanismo de supervivencia que puede conducir a un crecimiento exponencial en presencia de bajas concentraciones de antibiótico. Las respuestas horméticas también se han estudiado en relación con las NP87,92, pero actualmente no se conoce bien cómo se logran en las células bacterianas. Los autores actuales han intentado explicar estas mejoras inesperadas del crecimiento con referencia a un proceso no genético conocido como "persistencia".

Este mecanismo involucra subpoblaciones de células (células persistentes) que son menos afectadas por los agentes antibacterianos y por lo tanto sobreviven más tiempo que otras subpoblaciones más susceptibles 93. En ambientes con bajas concentraciones de Ag NPs (Ag+), el mecanismo de defensa de las células bacterianas tiene tiempo suficiente adaptarse a los efectos tóxicos de las NP de Ag. La respuesta 'SOS' 94 de la red reguladora de reparación del ADN se desencadena luego por la acumulación de ADN monocatenario anómalo dentro de la célula causado por los efectos genotóxicos de Ag NP.

Nuestro estudio reveló que las NP de Ag pueden reducir el crecimiento, prevenir la formación de biopelículas y eliminar las biopelículas de PA establecidas. Estos hallazgos resaltan el futuro prometedor de las Ag NP para usarse como agentes antimicrobianos alternativos o junto con antibióticos. Sin embargo, el desarrollo de la resistencia a la plata sigue siendo motivo de preocupación. Por lo tanto, se recomienda que la investigación se centre en examinar la acción combinada de Ag NP y antibióticos para comprender cómo funcionan contra diferentes microorganismos, especialmente cepas hospitalarias resistentes. Con el tiempo, las NP de Ag pueden convertirse en una terapia alternativa eficaz para combatir las infecciones. El control estratégico y el tratamiento de las infecciones por biopelículas serán más fáciles a medida que aumente nuestra comprensión del mecanismo de formación de biopelículas. La cascada de señalización de QS afecta a una variedad de actividades bacterianas, incluida la patogenicidad y la formación de biopelículas95. Al bloquear las cascadas de QS, se puede disminuir la patogenicidad y la virulencia bacterianas. Se requiere más investigación para confirmar el mecanismo molecular de Ag NP y QSI para prevenir el desarrollo de biopelículas de PA.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Artículo CAS Google Académico

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H Al-Momani recibió apoyo financiero del Departamento de investigación científica de la Universidad Hachemita/Jordania (1331).

Departamento de Microbiología, Patología y Medicina Forense, Facultad de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad Hachemita, Universidad Hachemita, Zarqa, 13133, Jordania

Hafez Al-Momani y Ashraf I. Khasawneh

Facultad de Ciencias Médicas Aplicadas, Universidad Hachemita, Zarqa, 13133, Jordania

Muna Almasri, Dua'A. Al Balawi, Lugain Ibrahim y Hadeel Albalawi

Departamento de Tecnología Farmacéutica y Farmacéutica, Facultad de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Hachemita, Zarqa, Jordania

Solo Hamed

Instituto de Nanotecnología, Universidad de Ciencia y Tecnología de Jordania, PO Box 3030, Irbid, 22110, Jordania

Borhan Aldeen Albiss

Supervisor del Laboratorio de Microbiología, Departamento de Medicina de Laboratorio, Hospital Universitario Jordan, Amman, Jordania

Nour Aldabaibeh

Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad Aplicada Al-Balqa', AL-Salt, Jordania

Sameer Al Haj Mahmud

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina, Universidad Hachemita, Zarqa, Jordania

De China

Institutos de Medicina Celular y Biociencias Celulares y Moleculares, Facultad de Medicina de la Universidad de Newcastle, Universidad de Newcastle, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Reino Unido

Matthew Wilcox y Christopher Ward

Departamento de Producción y Protección Vegetal, Facultad de Agricultura, Universidad de Jerash, Jerash, Jordania

Muayyad Bani-Hani

Instituto de Biociencias, Facultad de Medicina, Universidad de Newcastle, Newcastle Upon Tyne, NE2 4HH, Reino Unido

Muneef Aldhafeeri, Matthew Wilcox y Jeffrey Pearson

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JAMÓN. fue responsable del diseño del estudio, análisis formal, investigación, supervisó DA, MA, LI y HAB para la realización de los experimentos. JAMÓN. figuras preparadas y escritura—borrador original. DA, MA, LI y HAB: todos son asistentes de investigación y son responsables de realizar los experimentos bajo la supervisión de HA-MNA y MK responsables del aislamiento e identificación de cepas clínicas de PA. BA, SH, MA y SA: responsables de biosíntesis de nanopartículas de plata y caracterización de Nanopartículas. BA preparó la Fig. 1. MB: Realizó la identificación formal del Peganum harmala utilizado en este estudio. AK, MW, JP y CW responsables del diseño del estudio, coescribieron el manuscrito.

Correspondencia a Hafez Al-Momani.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Al-Momani, H., Almasri, M., Al Balawi, D. et al. La eficacia de las nanopartículas de plata biosintetizadas contra aislamientos de Pseudomonas aeruginosa de pacientes con fibrosis quística. Informe científico 13, 8876 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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Recibido: 23 febrero 2023

Aceptado: 25 de mayo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35919-6

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